CLiM™親和標(biāo)簽系統(tǒng)

CLiM ™ 親和標(biāo)簽系統(tǒng)基于兩種小蛋白質(zhì)之間形成的超高親和力復(fù)合物。 CL7 (16 kDa) 是與靶蛋白融合的標(biāo)簽，lm7 (10 KDa) 是與瓊脂糖樹脂偶聯(lián)的配體。 

CL7 的 WT 版本是 CE7 DNase，一種有毒細(xì)菌蛋白。工程突變消除了其 DNA 結(jié)合和 DNAse 活性，同時保留了與 lm7 的超高親和力。

成分 

CL7標(biāo)簽

CL7 標(biāo)簽可以表達在目標(biāo)蛋白的 N 或 C 末端。我們的質(zhì)粒提供溶解度標(biāo)簽、親和標(biāo)簽和切割位點的組合以及多種克隆選項。

在對照實驗中，CL7 對溶解度或表達沒有表現(xiàn)出負(fù)面影響。事實上，當(dāng)在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時，CL7 提高了原本不溶的蛋白質(zhì)的表達水平和溶解度。當(dāng)用 CL7 標(biāo)簽表達時，一些臨床和治療相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶性部分轉(zhuǎn)移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質(zhì)不需要變性劑或包涵體重折疊。這些蛋白質(zhì)在基于細(xì)胞的測定中表現(xiàn)出與其他商業(yè)/臨床樣品相同的生物活性。

Im7樹脂

lm7 樹脂由固定在瓊脂糖樹脂上的 CL7 結(jié)合伴侶 lm7 組成。 lm7 和 CL7 之間的高度特異性親和力導(dǎo)致樹脂脫靶最小化。 35-40 mg/mL 的高樹脂結(jié)合能力可以捕獲大量 CL7 標(biāo)記的蛋白質(zhì)。 lm7 結(jié)構(gòu)域具有高度彈性：使用 Gdn-HCI，樹脂可以再生并重復(fù)使用多達 100 次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對于從 lm7 樹脂柱上洗脫目標(biāo)蛋白至關(guān)重要。 TriAltus 生產(chǎn)自己的高活性、超高親和力純度的 SUMO 和 PSC 蛋白酶。這兩種 TriAltus 蛋白酶的裂解速度比競爭對手的產(chǎn)品更快，而且成本更低。 

例如，如果 60-80 mg 蛋白質(zhì)與 5 mL 柱結(jié)合，則 1 mg 蛋白酶溶于 20 mL 洗脫緩沖液中，流速為 0.2 mL/min，只需 1.5-2 小時即可洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶太稀了，可能不需要去除。如果需要，可以使用用于 SUMO 的鎳柱和用于 PSC 的谷胱甘肽來執(zhí)行拋光步驟。 

SUMO 

SUMO 蛋白酶用于洗脫 N 末端標(biāo)記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 SUMO 結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)并切割其 C 端，切割后不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 PSC 更快。 4°C 下， 1  μg SUMO 在 30 分鐘內(nèi)將 2 mg 底物裂解 96%，在 40 分鐘內(nèi)裂解 99%。

PSC 

PSC 蛋白酶用于切割 N 或 C 末端標(biāo)記的蛋白質(zhì)。它也非常高效：在 4 °C 下，20 μg PSC 將在 40 分鐘內(nèi)以 91% 的速度裂解 2 mg 底物，在 60 分鐘內(nèi)以 99% 的速度裂解 。

一步層析純化方案 

CL7 和 Im7 的鹽獨立性和高度特異性的結(jié)合親和力可實現(xiàn)簡單且簡化的實驗方案。 CL7 不是使用 His-trap 作為第一步，然后使用特殊標(biāo)簽來精煉蛋白質(zhì)，而是通過一個色譜步驟即可實現(xiàn)超高純度。

優(yōu)點

蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)根據(jù)其在兩個參數(shù)下的性能進行評估：產(chǎn)量和純度。  CLiM™  親和標(biāo)簽系統(tǒng)在兩個賬戶上的表現(xiàn)都優(yōu)于 His 標(biāo)簽和特殊標(biāo)簽。 

屈服

TriAltus 的高結(jié)合能力樹脂的高效偶聯(lián)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他專用標(biāo)簽的樹脂。 lm7 6B 樹脂的結(jié)合能力在 35-40 mg/mL 范圍內(nèi)，4B 樹脂的結(jié)合能力 >60 mg/mL。 

純度

蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)可達到的純度取決于其對未標(biāo)記細(xì)胞成分的敏感性。雜質(zhì)類型包括基于標(biāo)記靶蛋白/細(xì)胞成分相互作用的雜質(zhì)以及由于未標(biāo)記細(xì)胞成分與柱結(jié)合配體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。 

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩沖液存在的情況下，CL7 與 Im7 的結(jié)合不受干擾。高鹽緩沖液可在純化過程的早期去除雜質(zhì)，以獲得潔凈的最終產(chǎn)品。特殊標(biāo)簽對約 0.2-0.3 M 的鹽濃度敏感，導(dǎo)致第一個色譜步驟后純度較低。

非特異性結(jié)合

CL7 和 Im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標(biāo)簽或配體與細(xì)胞成分（例如 DNA 和其他蛋白質(zhì)）之間的非特異性相互作用。 IMAC 系統(tǒng)容易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結(jié)合。

高耐鹽性和高特異性結(jié)合的結(jié)合導(dǎo)致了如此高的純度，以至于 CL7/lm7 系統(tǒng)僅需要一個色譜步驟。

純化的具有挑戰(zhàn)性的蛋白質(zhì)

多亞基RNA聚合酶-ttRNAP

ttRNAP（嗜熱菌RNA 聚合酶）是一種約 400 kDa 的大蛋白，具有 5 個亞基 ( α 2 ββ'ω) 和 4 個結(jié)合位點。傳統(tǒng)上，純化需要五個連續(xù)的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實現(xiàn)高活性。蛋白質(zhì)純度與其活性直接相關(guān)。將細(xì)胞裂解物裝入 1.5 M 鹽緩沖液中是一步純度的關(guān)鍵。 CL7 標(biāo)簽僅附著在最大的 β' 亞基上， 不會干擾亞基組裝。 

DNA/RNA 結(jié)合蛋白 - Cas9

Cas9是CRISPR技術(shù)的重要組成部分。 Cas9 活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要 4-5 個色譜步驟才能達到所需的純度。 Cas9 帶有 CL7 標(biāo)簽并加載在 1.5 M 鹽緩沖液中，一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細(xì)胞檢測和 體外 檢測中均顯示出高活性。 

膜蛋白-YidC

YidC 是一種~32 kDa 細(xì)菌膜整合酶。膜蛋白很難純化，因為與細(xì)胞成分的疏水接觸會造成污染。由于組氨酸標(biāo)簽非特異性地結(jié)合到其柱上，因此在一步純化后會出現(xiàn)大量雜質(zhì)。 CL7 對 Im7 的特異性最大限度地減少了這些影響，使純度高達 99%。

折疊不良的治療蛋白 - GCSF、hGH 和 IFN- α

FDA 批準(zhǔn)的三種生物制劑——GCSF、hGH 和 IFN-α——各自具有兩個內(nèi)部半胱氨酸橋，在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時通常不溶。純化不溶性蛋白質(zhì)通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個色譜步驟。 CL7 增強蛋白質(zhì)的表達、穩(wěn)定性和折疊，使它們不再以包涵體形式表達。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與基于細(xì)胞的陣列中的其他商業(yè)/臨床樣品相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?nbsp;