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來(lái)源 | 解決方案 |
| 脫蠟不充分 | 延長(zhǎng)切片脫蠟時(shí)間或更換新鮮二甲苯 |
| 無(wú)活性的一抗 | 更換新一批抗體 |
| 由于儲(chǔ)存不當(dāng)，抗體無(wú)法發(fā)揮作用 | 將抗體分裝成較小的體積并儲(chǔ)存在冰箱中（-20 至 -70°C），并避免重復(fù)凍融循環(huán)。或根據(jù)制造商的說(shuō)明儲(chǔ)存抗體。 |
| 抗體濃度太低 | 增加一抗和/或二抗的濃度。或者運(yùn)行連續(xù)稀釋測(cè)試以確定提供最佳信噪比的最佳稀釋度 |
| 抗體 孵育時(shí)間不足 | 增加抗體 孵育時(shí)間 |
| 組織固定不充分或不正確 | 增加后固定時(shí)間或嘗試不同的固定劑 |
| 組織過(guò)度固定 | 減少后固定的持續(xù)時(shí)間。如果組織已經(jīng)過(guò)度固定，請(qǐng)執(zhí)行適當(dāng)或推薦的抗原修復(fù)程序。 |
| 二抗和一抗不相容 | 使用可與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗是從兔子中產(chǎn)生的，則使用抗兔二抗 |
| 無(wú)活性二抗 | 更換新一批抗體 |
| 無(wú)活性 ABC 試劑 | 更換新一批試劑 |
| 酶底物 系統(tǒng)有缺陷或不相容 | 更換新一批試劑 |
| 底物孵育時(shí)間不足 | 增加底物孵育時(shí)間 |
| 封固劑不正確 | 選擇正確的封固劑 |
| 試劑使用順序錯(cuò)誤或步驟省略 | 檢查注釋或使用的程序 |
來(lái)源 | 解決方案 |
| 一抗和/或二抗?jié)舛冗^(guò)高 | 降低抗體濃度或進(jìn)行滴定以確定一抗和二抗的最佳稀釋度 |
| 孵化時(shí)間太長(zhǎng) | 減少孵化時(shí)間 |
| 孵化溫度太高 | 降低孵化溫度 |
| 底物 孵育時(shí)間太長(zhǎng) | 減少底物孵育時(shí)間 |
| 切片變干 | 避免切片變干 |
來(lái)源 | 解決方案 |
| 切片清洗不充分 | 步驟之間至少清洗 3 次 |
| 組織含有內(nèi)源性酶，例如過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶 | 在孵育一抗之前，使用甲醇或左旋咪唑溶液（阻斷 AP）中的 3% 過(guò)氧化氫（阻斷過(guò)氧化物酶）阻斷內(nèi)源酶活性。 |
| 組織含有內(nèi)源性生物素活性 | 在孵育一抗之前，使用親和素/生物素封閉試劑封閉內(nèi)源生物素活性。 |
| 一抗與組織非特異性結(jié)合或抗體濃度過(guò)高 | 使用較高稀釋度的一抗可以減少非特異性結(jié)合 |
| 二抗與組織的非特異性結(jié)合 | 用來(lái)自同一物種的正常血清作為二抗處理組織。 |
| 二抗與類似物種的組織發(fā)生交叉反應(yīng)，即兔抗大鼠 IgG 可能與小鼠組織發(fā)生交叉反應(yīng)。 | 使用預(yù)吸附的第二抗體，即在小鼠組織上使用兔抗大鼠IgG，小鼠吸附，或在大鼠組織上使用兔抗小鼠IgG，大鼠吸附。 |
| 由于固定不充分導(dǎo)致組織抗原擴(kuò)散 | 增加后固定時(shí)間 |
| 用于小鼠組織的小鼠抗體 | 一抗孵育前用 MouseOnMouse 封閉試劑處理組織 |
切片變干 | 避免切片變干 |
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