重組蛋白廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。由于可用于商業(yè)用途的簡單方法的發(fā)展，重組蛋白的表達(dá)變得越來越普遍。最重要的是，它極大地增加了可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)和生化研究的蛋白質(zhì)數(shù)量。由于每種蛋白質(zhì)都是不同的，因此必須針對每種特定蛋白質(zhì)開發(fā)純化方法和技術(shù)，同時(shí)牢記蛋白質(zhì)的預(yù)期應(yīng)用。

我們討論了影響的眾多參數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)以及如何修改它們以提高它們在不同系統(tǒng)中的產(chǎn)量。

重組蛋白到底是什么？

重組蛋白被描述為“由重組DNA編碼的定制或修飾的蛋白"在合適的表達(dá)載體中編碼所需基因的質(zhì)粒在特定的宿主表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以產(chǎn)生一定量的蛋白質(zhì)用于科學(xué)研究、治療或診斷目的。

重組蛋白的大量應(yīng)用包括如下:

• 生化過程的研究，
• 接種疫苗，
• 蛋白質(zhì)的三維檢測

• 生物技術(shù)和治療實(shí)踐中的應(yīng)用。

產(chǎn)生重組蛋白需要將相關(guān)基因復(fù)制到表達(dá)載體中，同時(shí)受誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控。

然而，成功表達(dá)重組基因需要幾個變量，包括正確的蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞生長性狀以及轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的適當(dāng)表達(dá)指標(biāo)。在細(xì)菌表面展示重組蛋白在生物技術(shù)中有許多可能的用途；然而，這需要對通常在作為融合伴侶的載體蛋白上發(fā)現(xiàn)的靶向基序有更深入的理解。

此外，選擇表達(dá)系統(tǒng)需要了解開發(fā)、維持和其他經(jīng)濟(jì)因素的成本。

用于生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)

基因工程已經(jīng)使在細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動物甚至動物體內(nèi)生產(chǎn)有價(jià)值的重組蛋白成為可能植物細(xì)胞。這種生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，到2025年，其市場價(jià)值預(yù)計(jì)將達(dá)到4000億美元。

因?yàn)槊糠N宿主細(xì)胞都是不一樣的，所以不同的蛋白質(zhì)表達(dá)方法產(chǎn)生具有不同生物活性和穩(wěn)定性水平的重組蛋白質(zhì)并不罕見。糖蛋白包含超過50%的人類蛋白質(zhì)和大約四分之一的工業(yè)重組藥物蛋白質(zhì)。為了從這些重組蛋白中提取最多的蛋白質(zhì)，通常需要真核細(xì)胞作為糖基化的宿主。

雖然大多數(shù)商業(yè)生物仿制藥是使用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞制造的，但治療性重組蛋白的表達(dá)受到動物宿主細(xì)胞易受反饋抑制的限制。此外，昂貴的血清或生長因子的高制造成本和流行的動物感染的生物安全問題促使科學(xué)家們尋求非動物來源的真核細(xì)胞表達(dá)方法。由于其有利的特征，包括低生產(chǎn)成本、高生物安全性和蛋白質(zhì)后修飾特征，植物細(xì)胞是合成藥物重組蛋白的優(yōu)選。

由于目前正在進(jìn)行臨床研究的許多生物制藥蛋白質(zhì)，如治療性蛋白質(zhì)、抗原和抗體的有效表達(dá)，植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)獲得了國際關(guān)注。然而，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)仍然是商業(yè)水平上的好系統(tǒng)。

細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

說到生產(chǎn)重組蛋白，大腸桿菌是常見的來源之一。雖然大部分重組蛋白是在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的，但二硫鍵結(jié)合的重組蛋白經(jīng)常是在周質(zhì)中合成的。

氧化棲息地和駐留二硫鍵形成(Dsb)-系統(tǒng)可以通過將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)來增強(qiáng)適當(dāng)?shù)亩蜴I。將周質(zhì)用于具有二硫鍵的重組蛋白更好，但是穿過細(xì)胞質(zhì)屏障的靶向問題會顯著降低周質(zhì)產(chǎn)量。

讓我們看看涉及的因素和條件蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化在細(xì)菌蛋白質(zhì)系統(tǒng)中。

蛋白質(zhì)序列和基因?qū)扇苄院捅磉_(dá)的影響

導(dǎo)致異源蛋白質(zhì)不表達(dá)的一個普遍因素是在感興趣的mRNA中存在“奇怪的"密碼子。有可能通過密碼子增強(qiáng)的基因生產(chǎn)來避免這種密碼子異常。基因合成的一個好處是，它讓你改變基因的密碼子偏好，以便更好地與雜交宿主合作。

用不常見的tRNAs加強(qiáng)的表達(dá)批次可以克服大腸桿菌重組基因中固有的密碼子異常。

表達(dá)產(chǎn)量和溶解度都受到靶結(jié)構(gòu)域起始和末端殘基的影響。通過分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，我們可以找到構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的最佳位置。通過將感興趣的蛋白質(zhì)序列與同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相匹配，有可能確定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)的合適結(jié)構(gòu)域邊界。如果你沒有獲得同源蛋白質(zhì)復(fù)合物的途徑，你應(yīng)該使用二級解剖部分的預(yù)測。

載體對溶解性和表達(dá)的影響

DNA序列的某些部分，如Shine-Dalgarno盒、啟動子、調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制源等，控制所需基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄。此外，選擇元件被整合到表達(dá)載體中以促進(jìn)質(zhì)粒在靶細(xì)胞中的選擇。包含融合標(biāo)簽是大腸桿菌表達(dá)載體的另一個基本部分。

當(dāng)選擇啟動子框架時(shí)，應(yīng)該考慮下游應(yīng)用和蛋白質(zhì)靶類型。當(dāng)處理潛在有害的蛋白質(zhì)時(shí)，選擇基礎(chǔ)輸出水平較低的啟動子系統(tǒng)是明智的。另一方面，為了盡可能提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，必須選擇更有效的啟動子。對于易于聚集的蛋白質(zhì)，可以考慮的一個選擇是使用冷休克啟動子，允許在較低的溫度下表達(dá)。

來自細(xì)菌和其他更大的生物的蛋白質(zhì)通常折疊更長時(shí)間并粘在一起。在大腸桿菌中，折疊催化劑和蛋白質(zhì)伴侶可以用來防止蛋白質(zhì)粘在一起，同時(shí)使折疊更容易。兩種蛋白質(zhì)，一種在靶質(zhì)粒上編碼，另一種在獨(dú)立的質(zhì)粒上編碼，可以共表達(dá)。

融合標(biāo)簽在基因水平上附著在特定的蛋白質(zhì)上，使它們更易溶解或更容易被發(fā)現(xiàn)和純化。你通常必須嘗試幾種不同的標(biāo)簽，才能知道哪種融合標(biāo)簽?zāi)墚a(chǎn)生最易溶解的蛋白質(zhì)。此外，標(biāo)簽的定位至關(guān)重要，它可以位于感興趣的蛋白質(zhì)的C-末端或N-末端。大多數(shù)融合涉及N-末端，這種融合有一個優(yōu)勢:與C-末端的對應(yīng)蛋白相比，它通常提高了可溶性蛋白的表達(dá)。

考慮到融合標(biāo)簽的可用性可能阻礙重組合成蛋白的生物學(xué)功能，在融合蛋白純化后酶促消除標(biāo)簽可能是有用的。為了便于標(biāo)簽的去除，建議整合一個對給定序列*特的蛋白酶的分割部分。

宿主原種對異源蛋白表達(dá)的影響

細(xì)菌變體宿主的發(fā)展可以促進(jìn)異源蛋白質(zhì)的合成。一些商業(yè)銷售的大腸桿菌變異體被改造成產(chǎn)生具有特定特征的蛋白質(zhì)，例如那些易受蛋白水解、具有不尋常密碼子或需要二硫鍵的蛋白質(zhì)。

蛋白酶缺陷型變體，如大腸桿菌BL21或該菌株的其他變體，被推薦用于易受蛋白水解破壞的蛋白質(zhì)。當(dāng)靶基因和表達(dá)宿主的密碼子頻率不同時(shí)，會發(fā)生氨基酸誤摻入、翻譯過早終止和翻譯停滯。如果不尋常的tRNAs在表達(dá)過程中被提供，這種差異將成為過去。使用具有編碼稀有tRNAs的質(zhì)粒的細(xì)菌菌株，可以提高含有*特密碼子峰值頻率的基因的產(chǎn)量。

通過在包括谷胱甘肽還原酶(gor)和硫氧還蛋白還原酶(trxB)的宿主菌株中表達(dá)，可以提高含有二硫鍵的折疊蛋白的溶解性，并有助于胞質(zhì)二硫鍵的產(chǎn)生。大腸桿菌周質(zhì)氧化性很強(qiáng)，有利于二硫鍵的產(chǎn)生；在這種環(huán)境中靶向產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提供了表達(dá)含有二硫化物的蛋白質(zhì)的替代技術(shù)。

通過調(diào)節(jié)表達(dá)增加蛋白質(zhì)溶解度

使用有效的生產(chǎn)啟動子和高濃度的誘導(dǎo)劑可以在折疊前發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。如果轉(zhuǎn)錄和翻譯速率降低，新生成的蛋白質(zhì)在聚集之前將有更多的時(shí)間折疊。為了提高蛋白質(zhì)的溶解性，可以調(diào)整以下幾個典型方面的表達(dá)。

溫度:如果生產(chǎn)溫度降低到15-25 ℃,重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將更易溶解。降低的蛋白質(zhì)收集、翻譯、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂速率是由于在較低溫度下細(xì)胞過程變慢。當(dāng)表達(dá)特定蛋白質(zhì)的溫度降低時(shí)，易受蛋白水解影響的蛋白質(zhì)的分解速度減慢。

引發(fā)劑的效力:重組蛋白的溶解性和活性可以通過降低轉(zhuǎn)錄速率來增強(qiáng)，這可以通過降低誘導(dǎo)劑的濃度來實(shí)現(xiàn)。

選擇的媒介:最重組蛋白生產(chǎn)通過分批培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞。從一開始就將所有必需的營養(yǎng)物質(zhì)加入到生長培養(yǎng)基中是至關(guān)重要的。

優(yōu)化蛋白質(zhì)的純化

• 固定化金屬親和色譜(IMAC)應(yīng)該用作純化過程的第一階段。

• 當(dāng)需要進(jìn)一步純化時(shí)，使用凝膠過濾或尺寸排阻色譜法。必要時(shí)，離子交換色譜應(yīng)該作為“純化"的最后一步

• 有可能刪除親和標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)額外的純化并減少重組蛋白中存在的非原始序列的數(shù)量。

為大腸桿菌開發(fā)最佳表達(dá)系統(tǒng)

根據(jù)科學(xué)界目前的信息，建議開發(fā)一種適合大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)是安全的。它應(yīng)由促進(jìn)有效轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物、使翻譯穩(wěn)定、產(chǎn)生真正的重組蛋白而不被截短或延伸的變體污染、保持溶解性并聚集到總細(xì)胞蛋白的約20%的DNA成分組成。

這種類型的表達(dá)整合了管家啟動子s70所確認(rèn)的共有啟動子，并且它可以通過整合UP元件而經(jīng)歷額外的改善。誘導(dǎo)相鄰基因的通讀轉(zhuǎn)錄受到兩個缺乏任何因子的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子的串聯(lián)排列的阻礙。

在轉(zhuǎn)錄物兩端發(fā)現(xiàn)的反向重復(fù)穩(wěn)定了轉(zhuǎn)錄物本身。這些重復(fù)序列可以產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙5’端的核酸內(nèi)切酶活性和3’端的核酸外切酶破壞，但它們不抑制翻譯。最后，彈性Shine-Dalgarno序列、下游8bp的AUG起始密碼子和延長的UAAU終止密碼子確保了有效的翻譯。折疊分子伴侶隨著新的多肽鏈同時(shí)表達(dá)，幫助它們折疊。

然而，有必要指出這樣一個結(jié)論，即所有的重組蛋白都沒有一種*美生產(chǎn)方法。每種蛋白質(zhì)都有其挑戰(zhàn)。為了實(shí)現(xiàn)高度的合成，有必要通過系統(tǒng)地調(diào)整各種參數(shù)來優(yōu)化每種情況下的工藝。

結(jié)論

出于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模茖W(xué)家采用許多策略來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。與非常容易制造的DNA不同，蛋白質(zhì)只能由細(xì)胞或活組織的復(fù)雜混合物制造。通過特定表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的努力可能會從令人滿意且相對快速的操作迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫o張且耗時(shí)的過程。通過上述步驟，研究人員和科學(xué)家可以使用重組蛋白表達(dá)服務(wù)來克服這些障礙。

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